友康生物
2024-09-19
公司熱點(diǎn)大家在NK細(xì)胞培養(yǎng)過程中最關(guān)心哪些問題？我們收集了這些問題并對它們進(jìn)行了解答。這份NK培養(yǎng)的問題匯總解答，趕緊收藏起來吧！
1、細(xì)胞在正常培養(yǎng)到八九天后，細(xì)胞增殖忽然變慢，甚至停止增殖，但活率很高，是什么原因？
答：①入袋損失的細(xì)胞太多，具體表現(xiàn)于入袋時(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)移不充分、培養(yǎng)基預(yù)溫不到位、入袋后沒有對折袋子、后期含有IL-2的培養(yǎng)基反復(fù)預(yù)溫等原因；②前期接種量與試劑盒要求的范圍相差過大。
2、每次培養(yǎng)之前需要FACS測試PBMC中NK的含量嗎？若是含量在5%左右，算是正常樣本還是屬于特殊樣本呢？培養(yǎng)NK之前，測PBMC中NK的含量是必須的嗎？
答：最好是測一下，初始5%屬于較難養(yǎng)的樣本，若使用友康的標(biāo)準(zhǔn)版NK可能最終陽性率就會(huì)有60%~90%的較大波動(dòng)，但使用高性能培養(yǎng)至90%陽性率以上問題不大。
3、血是什么抗凝保存運(yùn)輸?shù)模?/strong>
答：最合適的抗凝劑是肝素鹽抗凝，但一般采集臍血用的是枸櫞酸鈉抗凝袋。
4、假設(shè)5E7的PBMC，培養(yǎng)到D16可以獲得多少億NK？純度多少？需要多少培養(yǎng)基？目前使用的培養(yǎng)基可以容納的最高培養(yǎng)密度是多少？可以達(dá)到3E6/mL嗎？
答：5E7單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)到D16一般可以獲得70億以上細(xì)胞數(shù)，純度90%以上，使用2.2L培養(yǎng)基。目前的培養(yǎng)基可以最高承載6.2E6/mL的細(xì)胞密度（客戶案例）。
5、吸白膜層第一次清洗用700g離心，10min，升9，降9。這個(gè)離心條件是否會(huì)損害細(xì)胞？
答：經(jīng)過友康多次測試、工藝優(yōu)化，700g離心不會(huì)對細(xì)胞活率有明顯影響。
6、血小板裂解物和血替有什么區(qū)別？
答：血小板裂解物就是指血清替代物，都是人源血小板裂解后的產(chǎn)物，通過生產(chǎn)級別區(qū)分GMP級與科研級。
7、脂血樣本的處理方法是什么？
答：血脂不明顯的樣本，自體血漿可直接使用。若出現(xiàn)明顯膠質(zhì)或不透明自體血漿，建議使用血清替代物代替自體血漿添加。
8、細(xì)胞接種時(shí)，接種密度稍大一些會(huì)有什么不良影響嗎？
答：密度稍大一些沒有較大影響。若接種密度明顯高出試劑盒范圍，則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞和因子結(jié)合不充分，細(xì)胞數(shù)和陽性率可能還不及密度在合適范圍接種。接種密度：新鮮外周血：1.5E6~2E6 cells/mL；新鮮臍血: 3E6~3.5E6 cells/mL；凍存外周血：活細(xì)胞2.5~3E6 cells/mL；凍存臍血、長距離運(yùn)輸臍血: 3.5E6~4E6 cells/mL。以上特殊樣本接種是要高于正常樣本，用數(shù)量換取質(zhì)量。
9、細(xì)胞培養(yǎng)到第7天需要入袋嗎？
答：正常補(bǔ)液情況下是Day7入袋，若出現(xiàn)延遲補(bǔ)液可能Day9才能入袋。
10、細(xì)胞量不夠的時(shí)候可以減少培養(yǎng)基的量嗎？
答：出現(xiàn)明顯不夠的情況可以按照接種密度，略微調(diào)整培養(yǎng)基添加量。如T75體系正常添加30mL培養(yǎng)基，調(diào)整為20mL培養(yǎng)基，但最好的方案是同時(shí)備上T25版本（AN0104）和T75版本（AN0104-2）試劑。
11、外周血要裂紅計(jì)數(shù)嗎？
答：一般沒有必要。
12、為啥新鮮的外周血和臍血分離的PBMC，接種密度有差異呢？
答：首先是因?yàn)槟氀忍毂韧庵苎屑?xì)胞增殖較慢，前期提高接種量加大細(xì)胞間的相互作用。第二是臍血接種會(huì)引入大量雜細(xì)胞，實(shí)際上可激活的單個(gè)核細(xì)胞遠(yuǎn)低于我們計(jì)數(shù)出來的細(xì)胞，要用數(shù)量換取質(zhì)量。
13、運(yùn)輸血液樣本的注意事項(xiàng)是什么？
答：2~8℃溫度盡量穩(wěn)定，同時(shí)使用轉(zhuǎn)運(yùn)箱，避免血樣有劇烈震蕩。
14、友康本次實(shí)驗(yàn)采用的特殊樣本細(xì)胞計(jì)數(shù)多少？
答：友康本次實(shí)驗(yàn)采用的特殊樣本總體積100mL血分離1.2E8單個(gè)核細(xì)胞，而正常新鮮樣本分離3~4E8單個(gè)核細(xì)胞。
15、血漿為什么是紅色的？
答：出現(xiàn)了溶血。
16、為什么叫修復(fù)培養(yǎng)基（NC0102.F），有什么作用？
答：免疫修復(fù)培養(yǎng)基是高性能套裝中的核心產(chǎn)品，本質(zhì)上使受損或質(zhì)量不佳的單個(gè)核細(xì)胞能夠更好地結(jié)合細(xì)胞因子，讓激活收到影響的細(xì)胞盡可能快速回歸正常的激活軌道，配合后續(xù)的擴(kuò)增培養(yǎng)基能夠?qū)崿F(xiàn)“先修復(fù)后激活” 的使用原理。
17、包被后的培養(yǎng)瓶最長可以放多長時(shí)間？
答：正常包被是37℃ 2h，若包被完成后不使用可以將包被液倒掉加入DPBS放入2~8℃保存，12h以內(nèi)使用。
18、包被是什么目的？
答：①提供初始的激活環(huán)境；②盡可能壓制CD3+細(xì)胞群。
19、PBMC的最低接種量多少？
答：最低是1.5E6/mL。
20、DPBS可以換成PBS嗎？
答：不含鈣鎂離子的DPBS或PBS都可以，生理鹽水也可以。
21、為什么臍帶血一定要稀釋？
答：盡可能減少分白膜層時(shí)紅細(xì)胞引入進(jìn)單個(gè)核細(xì)胞層。
22、本次實(shí)驗(yàn)用的是友康FEP細(xì)胞培養(yǎng)袋嗎？
答：是的，友康FEP細(xì)胞培養(yǎng)袋，相較于傳統(tǒng)EVA材質(zhì)，氣體交換面積大，相同培養(yǎng)體系下一般可獲得30%以上細(xì)胞數(shù)量提升。FEP為100%惰性材質(zhì)，可以耐受大多數(shù)有機(jī)溶劑和酸堿介質(zhì)的腐蝕，無細(xì)胞和組織毒性，可在-196°C（液氮）到+137°C（高壓滅菌）之間保持柔韌度。玻璃般透明的高透光材質(zhì)，易于觀察細(xì)胞狀態(tài)。
23、臍血樣本，沒有自體血漿用什么代替呢？添加量是怎樣的？
答：若出現(xiàn)外周血自體血漿質(zhì)量不佳或者臍血血漿抗凝劑比例過高的情況，可使用血清替代物或優(yōu)質(zhì)胎牛血清作為自體血漿平替，添加量同自體血漿量相同。品牌需私下咨詢友康技術(shù)或銷售。
24、滅活血漿的方法是什么？
答：56℃水浴30min。
25、200mL采血袋，只采了50mL臍帶血，再分離的時(shí)候是否有影響？
答：有影響，會(huì)導(dǎo)致分離得到的血漿質(zhì)量不佳。為了避免抗凝劑占比過高影響自體血漿的使用，應(yīng)使臍血中的抗凝劑占比低于30%。如用采血袋采集血樣，建議使用100mL容量的采血袋。如果采血時(shí)用200mL采血袋，建議取出14mL抗凝劑。
26、凍存PBMC復(fù)蘇培養(yǎng)，凍存的密度多少合適？
答：若使用友康單個(gè)核細(xì)胞專用凍存液，凍存密度建議3E6~2E7個(gè)細(xì)胞/mL。
27、血漿滅活后是否需要低溫靜置，待蛋白析出？
答：需要低溫靜置，56℃滅活后放-20℃冰箱，急冷15min即可。
28、NK細(xì)胞培養(yǎng)過程中，可能會(huì)造成陽性率不高的因素有哪些？
答：①樣本質(zhì)量不佳，分離出單個(gè)核細(xì)胞中NK細(xì)胞比例低，CIK比例高；②轉(zhuǎn)瓶、入袋損失的細(xì)胞太多，具體表現(xiàn)于轉(zhuǎn)瓶、入袋時(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)移不充分、培養(yǎng)基預(yù)溫不到位、入袋后沒有對折袋子、后期含有IL-2的培養(yǎng)基反復(fù)預(yù)溫等原因。
29、補(bǔ)液后是否需要排出培養(yǎng)袋里的氣體？
答：友康FEP細(xì)胞培養(yǎng)袋采用的是FEP這種高透氣性材料，培養(yǎng)袋表面積也比較大，不需要單獨(dú)排氣。
30、補(bǔ)液后應(yīng)該控制密度在多少/mL？
答：一般控制在0.5~0.8E6/mL。
31、友康FEP細(xì)胞培養(yǎng)袋最多的培養(yǎng)體系是多少毫升?
答：現(xiàn)在友康FEP細(xì)胞培養(yǎng)袋匹配完整的2.2L培養(yǎng)體系。
32、采血時(shí)不確定采到的血樣體積，怎么選擇采血袋才能確保抗凝劑不超標(biāo)？
答：一般選擇100mL體積的采血袋，里面自帶14mL抗凝劑，無論血樣多或少抗凝劑的含量可控。
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