核酸提取的方法及原理

核酸分為脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），其中RNA又可以根據(jù)功能的不同分為核糖體RNA(rRNA)，信使RNA（mRNA）和轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）。

DNA主要集中在細(xì)胞核內(nèi)，線粒體和葉綠體中，而RNA主要分布在細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中。

核酸中因?yàn)猷堰蕢A和嘧啶堿具有共軛雙鍵，所以核酸具有紫外吸收的特性，DNA鈉鹽的紫外吸收在260nm附近，其吸光率以A260表示，在230nm處于吸收低谷，因此可以使用紫外分光光度計(jì)對(duì)核酸進(jìn)行定量及定性測(cè)定。

核酸為兩性電解質(zhì)，相當(dāng)于多元酸，可以使用中性或偏堿性的緩沖液使核酸解離成陰離子，置于電場(chǎng)中向陽(yáng)極運(yùn)動(dòng)，這就是電泳的原理。

核酸提取純化原則和要求：

1、保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；

2、排除其它分子的污染（如提取DNA時(shí)排除RNA的干擾）；

3、核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和高濃度的金屬離子;

4、盡可能降低蛋白質(zhì)、多糖和脂類等大分子物質(zhì)。

核酸提取純化方法：

1、酚/氯仿抽提法

1956年發(fā)明，通過(guò)酚/氯仿處理細(xì)胞破碎液或者組織勻漿后，在水相中主要溶解以DNA為主的核酸成分，在有機(jī)相中主要是脂類物質(zhì)，蛋白質(zhì)位于兩相之間。

2、醇沉淀法

乙醇能夠消除核酸的水化層，使帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)暴露出來(lái)，NA﹢等帶正電荷離子能與磷酸基團(tuán)結(jié)合，形成沉淀。

3、層析柱法

通過(guò)特殊硅基質(zhì)吸附材料，能夠特定吸附DNA，而RNA和蛋白質(zhì)順利通過(guò)，然后利用高鹽低PH結(jié)合核酸，低鹽高PH值洗脫，來(lái)分離純化核酸。

4、熱裂解堿法

堿法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來(lái)分離他們，在堿性下，變性蛋白是可溶的。

5、煮沸裂解法

加熱處理DNA溶液，利用線性DNA分子的特性，通過(guò)離心將DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片形成的沉淀分離。

6、納米磁珠法

運(yùn)用納米技術(shù)對(duì)超順磁性納米顆粒的表面進(jìn)行改良和表面修飾后，制備成超順磁性氧化硅納米磁珠。該磁珠能在微觀界面上與核酸分子特異性地識(shí)別和高效結(jié)合。利用氧化硅納米微球的超順磁性，在Chaotropic鹽(鹽酸胍、異硫氰酸胍等)和外加磁場(chǎng)的作用下，從血液、動(dòng)物組織、食品、病原微生物等樣本中分離出DNA和RNA。

7、其他方法

除了上述常用的方法之外，還有超聲法、反復(fù)凍融法、酶解法及低滲裂解等等多種方法。

8、核酸提取類型

1、總RNA提取

總RNA中，75-85%為rRNA(主要是28S-26S/23S和18S/16S rRNA)，其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、5S rRNA、5.8S rRNA、miRNA、siRNA、小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）及核仁小分子RNA（small nuceolar RNA，snoRNA）等組成。

2、miRNA提取

MicroRNAs (miRNAs)是小型的、高度保守的RNA分子，如小干擾RNAs (siRNAs)，通過(guò)與他們的堿基配對(duì)調(diào)節(jié)其同源mRNA的分子表達(dá)，以預(yù)防通過(guò)各種機(jī)制的表達(dá)。他們已成為進(jìn)行發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞周期的重點(diǎn)監(jiān)管機(jī)構(gòu)。

3、基因組DNA提取

進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和功能研究以及基因診斷，通常要求得到的片段長(zhǎng)度不小于100～200kb。在DNA提取過(guò)程中應(yīng)盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

4、質(zhì)粒抽提

質(zhì)粒抽提方法即去除RNA，將質(zhì)粒與細(xì)菌基因組 DNA分開(kāi)，去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)，以得到相對(duì)純凈的質(zhì)粒。