細胞凍存的步驟有哪些？

細胞凍存是將細胞放在低溫環(huán)境，減少細胞代謝，以便長期儲存的一種技術。細胞凍存是細胞保存的主要方法之一，起到了細胞保種的作用。

下面咱們來了解細胞凍存的步驟有哪些吧！

(一)細胞凍存

1、配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液;

2、取對數(shù)生長期的細胞，去除舊培養(yǎng)液，用PBS清洗。

3、去除PBS，加入適量胰蛋白酶(覆蓋培養(yǎng)皿表面)把單層生長的細胞消化下來;

4、離心1000rpm，5min;

5、去除胰蛋白酶，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml;

6、將細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml;

7、在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者;

8、凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/ min;當溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min;到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。

(二) 細胞復蘇

1、從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化。

2、從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻;

3、離心， 1000rpm，5min;4. 棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)，調(diào)整細胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng);5. 次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。